巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析

巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析

李辉亮, 郭冬, 彭世清*

(中国热带农业科学院热带生物技术研究所，农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101)

摘要： 为探讨巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)自根幼态无性系与供体间差异产生的原因，应用甲基化敏感扩增多态性扩增技术，对巴西橡胶树体细胞胚发生过程中基因组DNA胞嘧啶甲基化程度和模式进行了分析。结果表明，在巴西橡胶树体细胞胚发生过程中不同阶段的DNA甲基化程度不同，以花药的DNA甲基化程度最高，体细胞胚的DNA甲基化水平最低。在体细胞胚发生过程中出现了I、Ⅱ和Ⅲ 3种类型的甲基化多态性带型的改变，包括他们的出现与消失。因此，橡胶树体细胞胚发生过程中可能通过DNA甲基化甲基化和去甲基化来调控基因的表达。关键词：橡胶树；体细胞胚；DNA甲基化；甲基化敏感扩增多态性doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.05.007

Changes in DNA Methylation during Somatic Embryogenesis of Hevea brasiliensis

LI Hui-liang, GUO Dong, PENG Shi-qing*

(Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China)

Abstract: In order to understand the causes of differences between self-rooting juvenile clone and donors of Hevea brasiliensis, the extent and pattern of cytosine methylation in genomic DNA of H. brasiliensis were studied by using methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP). The results showed that MSAP profiles of genomic DNA were different during somatic embryogenesis. The genomic DNA methylation of anther was the highest among all tissues, while that of somatic embryo was the lowest. Changes in types of MSAP bands among different tissues were frequently observed, including appearance and disappearance of types I, II, and III MSAP bands. Therefore, the gene expression could be regulated by DNA methylation or demethylation during somatic embryogenesis of H. brasiliensis.

Key words: Hevea brasiliensis; Somatic embryogenesis; DNA methylation; Methylation-sensitive amplification

polymorphism

表观遗传是指不因DNA序列变化而发生的基因功能改变，这种改变又可随细胞的有丝分裂和/ 或减数分裂而遗传的现象。基因组DNA甲基化是表观遗传修饰的主要形式，是调节基因功能的重要手段。植物核基因组中胞嘧啶甲基化是一种普遍

的现象，5-甲基胞嘧啶(5-m-C)水平与基因组的重复序列水平相关。不同物种中DNA甲基化程度差异较大，如小麦(Triticum aestivum)基因组中约有而银杏(Ginkgo biloba)基因33%的甲基化胞嘧啶[1]，

组中大约有44%的胞嘧啶被甲基化[2]。DNA甲基

收稿日期： 2014–11–17　　　　接受日期： 2015–01–27

基金项目： 国家自然科学基金项目(31170634); 海南省重大科技项目(ZDZX2013023-1)资助作者简介： 李辉亮，男，博士，副研究员，研究方向为植物分子遗传。E-mail: lihui7532@126.com* 通信作者 Corresponding author. E-mail: shqpeng@163.com

528热带亚热带植物学报第23卷

化可以引起DNA高级结构的变化从而引发一系列的生物学功能，广泛参与细胞的脱分化及再分化、染色质结构的改变和基因组印记的调节等，在调控细胞的分化和维持细胞状态稳定中起着重要的作用[3–7]。DNA甲基化水平随环境条件及植物生长发育的进程而发生变化。过高或过低的甲基化水平都会导致植物生长发育的异常[8]。因此，DNA甲基化对于生物的生长发育具有非常重要的调控作用。

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)自根幼态无性系是通过花药组织培养获得的一种橡胶树种植材料，具有生长速度快、产胶量高、抗逆性强等特性，有可能作为新一代的橡胶树种植材料[9–11]。目前对巴西橡胶树自根幼态无性系高产机制的研究仅限于形态学观察、排胶生理参数等，而缺乏直接的遗传、分子生物学等方面的证据，在一定程度上限制了巴西橡胶树自根幼态无性系在生产中的应用和大面积推广[12]。巴西橡胶树自根幼态无性系和供体老态无性系的遗传物质DNA序列应该是相同的，组织培养在正常情况下不会改变遗传物质DNA的序列，因此自根幼态无性系与供体之间所表现出的差异，可能与表观遗传相关。本研究利用甲基化敏感多态性扩增(Methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)方法对巴西橡胶树花药组织培养过程中 DNA 甲基化的动态变化进行了分析, 以期从表观遗传的角度探讨巴西橡胶树自根幼态无性系和供体之间产生差异的原因, 为研究巴西橡胶树自根幼态无性系的遗传机制提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

巴西橡胶树‘海垦2’(Hevea brasiliensis Muell. Arg. ‘Haiken 2’)花药组织培养再生植株由中国热带农业科学院热带生物技术研究所陈雄庭研究员提供。分别采集不同发育阶段的材料，包括花药、愈伤组织、体细胞胚、再生植株幼芽、再生植株叶和移栽大田植株芽，采集后迅速置于液氮中，于–70℃冰箱保存备用。

大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α由本实验室保存。EcoRⅠ、HpaⅡ、MspⅠ内切酶、T4 DNA连接酶为Forments公司产品。pMD19-T载体、Taq DNA聚合酶和随机引物DNA标记试剂盒为

TaKaRa公司产品，DNA凝胶回收用试剂盒购自

Tiangen公司，α-32pdCTP为北京市福瑞生物工程公司产品，杂交尼龙膜为法玛西亚公司产品。1.2 基因组DNA的提取与纯化

基因组DNA的提取与纯化参照王关林等[13]的方法。取1~2 g材料，用液氮研磨粉碎，加入DNA提取液(含1.5%的CTAB，1%巯基乙醇)，65℃水浴90 min，加入氯仿∶异戊醇(24∶1)，抽提2次后，加RNA酶37℃温浴过夜，苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)进行纯化，样品DNA溶于1×TE (pH 8.0)缓冲液中，–20℃保存备用。1.3 MSAP分析

MSAP分析参照Xiong等[14]和Portis等[15]的方法。分别用EcoR I/Hpa II、EcoR I/Msp I组合对基因组DNA进行酶切，连上接头，采用MSAP扩增程序[14]进行2轮扩增，

接头、引物序列见表1。扩增产物经上样缓冲液变性后，用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测、多态性甲基化片段从变性聚丙烯酰胺凝胶的回收均按北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供的方法。甲基化多态性条带统计中，清晰的条带记为1”，无带记为“0”。根据EcoRⅠ/MspⅠ扩增条带的差异，

统计各种材料基因组HpaⅡ或EcoDNARⅠ/ 甲基化水平。再根据同一位点甲基化的差异，分析

DNA甲基化模式的差异及3种MSAP条带类型的转变。

1.4 多态性甲基化片段的扩增、测序

以回收片段为模板，采用原引物组合和选择性扩增程序进行PCR扩增。所得PCR产物经纯化回收后克隆到pMD19-T载体上。序列测定由上海Invitrogen生物技术有限公司完成。利用公共数据库NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对和分析。

1.5 Southern杂交分析

用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ对花药组织培养再生植株不同发育阶段的基因组DNA进行酶切，采用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行分离并转膜，以已经克隆的片段为探针进行Southern杂交。探针标记按TaKaRa公司随机引物DNA标记试剂盒使

“第5期李辉亮等：巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析529

表1 MSAP接头和引物

Table 1 Adapters and primers in MSAP

接头和引物 Adapter and primer

接头 Adapter

EcoR IEcoR IHpa II/Msp IHpa II/Msp I

预扩增引物

Pre-amplification primer选择性扩增引物

Selective amplification primer

EcoR I +AHpa II/Msp I+TEcoR I+AAGEcoR I+AAAEcoR I+ACCEcoR I+ACTEcoR I+ATAEcoR I+ATCEcoR I+AGTEcoR I+AGGHpa II/Msp I +TAAHpa II/Msp I +TATHpa II/Msp I +TCGHpa II/Msp I +TACHpa II/MspI +TTTHpa II/Msp I +TTAHpa II/Msp I +TTCHpa II/Msp I +TCGHpa II/Msp I +TCAHpa II/Msp I +TGCHpa II/Msp I +TGGHpa II/Msp I +TGT

序列 Sequence (5′~3′)CTCGTAGACTGCGTACCAATTGGTACGCAGTCTACGACGATGAGTCTAGAACGTTCTAGACTCATCGTAGACTGCGTACCAATTCAGATGAGTCTAGAACGGTGACTGCGTACCAATTCAAGGACTGCGTACCAATTCAAAGACTGCGTACCAATTCACCGACTGCGTACCAATTCACTGACTGCGTACCAATTCATAGACTGCGTACCAATTCATCGACTGCGTACCAATTCAGTGACTGCGTACCAATTCAGGGATGAGTCCTGAGCGGTAAGATGAGTCCTGAGCGGTATGATGAGTCCTGAGCGGTCGGATGAGTCCTGAGCGGTACGATGAGTCCTGAGCGGTTT GATGAGTCCTGAGCGGTTA GATGAGTCCTGAGCGGTTCGATGAGTCCTGAGCGGTCGGATGAGTCCTGAGCGGTCA GATGAGTCCTGAGCGGTGCGATGAGTCCTGAGCGGTGGGATGAGTCCTGAGCGGTGT

用说明书进行，Southern杂交按照Sambrook等[16]方法进行。

株芽中类型Ⅰ的甲基化多态性条带分别为1197、1194、1192、1199、1183和1191；类型Ⅱ的分别为288、283、275、272、285和289；类型III的分别为64、60、55、62、59和56。花药、愈伤组织、体细胞胚、再生植株幼芽、再生植株叶和移栽大田植株芽DNA总甲基化位点的甲基化水平分别为22.724%、22.316%、21.682%、21.787%、22.528%和22.461%，以体细胞胚的甲基化水平最低(21.682%)，再生植株幼芽的次之，花药的最高(22.724%)。

巴西橡胶树体细胞胚发生过程出现了一些组织特异性的甲基化多态性条带(图1)。随着体细胞胚的发育，各阶段都会出现不同甲基化多态性带型的改变，包括不同类型条带的出现或消失，和不同

2 结果和分析

2.1 体细胞胚发生过程的DNA甲基化

从表2可见，采用35对引物分别从花药、愈伤组织、体细胞胚、再生植株幼芽、再生植株叶和移栽大田植株芽的基因组DNA中扩增出1549、1537、1522、1533、1527和1536条甲基化多态性条带，其中以花药外植体的甲基化多态性条带最多(1549)，体细胞胚的最少(1522)。甲基化多态性条带有Ⅰ、Ⅱ和III等3种类型，花药、愈伤组织、体细胞胚、再生植株幼芽、再生植株叶和移栽大田植

530热带亚热带植物学报第23卷

表2 巴西橡胶树体细胞胚发生过程中基因组DNA的甲基化

Table 2 DNA methylation during somatic embryogenesis of Hevea brasiliensis

组织Tissue

花药Anther愈伤组织Callus体细胞胚

Somatic embryo再生植株幼芽

Bud of regenerated plant再生植株叶

Leaf of regenerated plant 移栽大田植株芽

Bud of transplanting plant

条带类型Band typeⅠ119711941192119911831191

Ⅱ288283275272285289

Ⅲ646055625956

总数Total154915371522153315271536

甲基化总位点数(Ⅱ+Ⅲ) Numberof methylated sites

352343330334344345

总甲基化率Total Methylation

rate (%)

22.72422.31621.68221.78722.52822.461

内部甲基化率外部半甲基化率Internal methylationExternal hemi-rate (%)methylation rate (%)

18.59318.41218.06817.74318.66418.815

4.1323.9043.6144.0443.8643.646

类型条带的相互转换，有超过17种以上的模式(表3)。从花药诱导为愈伤组织时，类型I、Ⅱ和III的甲基化多态性带分别有10、7、2条带消失；从愈伤组织发育为体细胞胚时类型Ⅱ的甲基化多态性带消失最多，达19条，类型III消失的条带数为11；体细胞胚发育为再生植株幼芽的过程中，消失和出现的类型I条带都比较多。可见，类型I甲基化多态性带的变化最大(表4)。2.2 甲基化多态性片段的验证

为了进一步验证甲基化多态性的真实性，分别选取一条类型Ⅱ和III的甲基化多态性片段作探针进行Southern杂交验证。结果表明，杂交出的条带与MSAP的带型一致(图2)，表明甲基化条带多态性的真实可靠。而多出的一些或大或小的杂交条带可能是巴西橡胶树基因组中具有高同源性的序列或同源的多拷贝基因，由于杂交探针序列过短造成的非特异杂交。

图1 引物组合EcoR I+AAC-Hpa II/Msp I+TAG在体细胞胚发生过程的DNA甲基化变化。L：标准分子量； H： M：EcoRⅠ/HpaⅡ酶切； 1：花药； 2：愈伤组织； 3：体细胞胚； 4：再生植EcoRⅠ/MspⅠ酶切；

株幼芽； 5：再生植株叶； 6：移栽大田植株芽； A、 B、 C、 D分别表示类型I、Ⅱ、Ⅲ及组织特异性MSAP条带。

Fig. 1 Changes in DNA-methylation by combination primers of EcoRI+ AAC-Hpa II/Msp I+TAG. L: Standard molecular marker; H: Digested by EcoR I/Hpa II; M: Digested by EcoR I/Msp I; 1: Anther; 2: Callus; 3: Somatic embryo; 4: Bud of regenerated plant; 5: Leaf of regenerated plant; 6: Bud of transplanting plant; A, B, C, and D present MSAP bands of type I, type II, type III, and tissue-specific band, respectively.

2.3 甲基化片段的序列分析

随机选取14条组织特异性的条带进行回收，采用相同的选择性扩增引物进行二次扩增，将扩增产物克隆到pMD19-T载体上送测序公司进行测序。通过NCBI在GenBank公共数据库中对获得的序列进行BLAST比对，结果表明，有6个片段与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ABC transporter、 ATP-binding protein、ASYMMETRIC LEAVES 2、acyl-CoA synthetase、acyltransferase-like protein、

第5期李辉亮等：巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析531

表3 巴西橡胶树体胚发生过程中不同组织的MSAP模式

Table 3 MSAP patterns and their respective abundance during somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis

序号No.1234567891011121314151617181920其他Others

ⅡⅠⅠ　

ⅠⅡⅠⅠ　

ⅠⅡⅡⅠ　

ⅠⅡⅠ　

ⅠⅡⅠ　

ⅠⅡⅡ　

Ⅰ

花药AntherⅠⅡⅢⅠⅡⅢ

ⅠⅡ

ⅠⅡⅢ

ⅠⅢ

ⅠⅢ

愈伤组织CallusⅠⅡⅢ

体细胞胚Somatic embryo

ⅠⅡⅢ

再生植株幼芽Bud of plant

ⅠⅡⅢ

再生植株叶Leaf of regenerated plant

ⅠⅡⅢ

移栽大田植株芽Bud MSAP条带数of transplanting plantNumber of MSAP bands

ⅠⅡⅢ

1120245655313253232212221131

表4 巴西橡胶树体胚发生过程MSAP条带的变化

Table 4 Changes in MSAP band type during somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis

带型变化花药愈伤组织体细胞胚再生植株幼芽 Bud再生植株叶 Leaf 移栽大田植株芽Bud 总数

→→→→→

Band changeAntherCallusSomatic embryoof regenerated plantof regenerated plant of transplanting plantTotalIa → IdIIa → IIdIIIa → IIId Id → IaIId → IiaIIId →IIIaI → III → IIIII → IIII → I

10727326124

619115632432

12451651235101

175341237426

5638754117

50412440332522151820

a: 出现； d: 消失。

a: Appearance; d: Disappearance.

532热带亚热带植物学报第23卷

图2 DNA甲基化的Southern blot验证。A: 类型Ⅱ； B：类型Ⅲ； L: 标准分子量； H: EcoRⅠ/HpaⅡ酶切； M: EcoRⅠ/MspⅠ酶切； 1: 花药； 2: 愈伤组织； 3: 体细胞胚； 4: 再生植株幼芽； 5: 再生植株叶； 6: 移栽大田植株芽。

Fig. 2 Verification of DNA methylation by Southern blot. A: Type II; B: Type III; L: Standard marker; H: Digested by EcoR I/Hpa II; M: Digested by EcoR I/Msp I; 1: Anther; 2: Callus; 3: Somatic embryo; 4: Buds of regenerated plant; 5: Leaves of regenerated plant; 6: Bud of transplanting plant.

ATOFP1/OFP1 (Ovate family protein 1)和protein binding/ transcription repressor片段具有很高的同源性，而另外8个片段没有找到同源的基因片段。

基化的情况，不同时期DNA甲基化或去甲基化会分别占主导地位，从愈伤组织到体细胞胚阶段去甲基化比较明显，这与体细胞胚再分化时需启动大量基因表达相一致。而在后续发育过程中类型II或III的甲基化条带增加比较明显，表明部分基因正在关闭或沉默。

对部分特异性甲基化DNA片段进行同源比对，结果表明，14个甲基化多态性DNA片段中有6个片段的基因编码区能找到同源序列，8个找不到同源序列，这些找不到同源序列的甲基化片段很有可能就是基因的启动子区域或内含子区域，这与Cervera等[22]对拟南芥的研究结果相似。这6个片段中，有与ABC transporter和ATP-binding protein基因的同源片段，拟南芥中ABC transporter和ATP-binding protein与光形态建成和幼苗根早期发有与ASYMMETRIC LEAVES 2基因的育相关[23–24]；

同源片段，ASYMMETRIC LEAVES 2在拟南芥中参与叶的极性建立[25]。这些与巴西橡胶树体细胞胚发生有关的基因片段, 可为进一步研究橡胶树体细胞胚发生与特异基因表达调控的关系提供线索。参考文献

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3讨论

高等植物因组DNA甲基化程度因种类而异，从4.6%~40%不等。本研究巴西橡胶树的平均甲基化率约为22.25%，低于毛竹(Phyllostachys

[17]

而高于水稻(Oryza sativa, heterocycla)的32.12%，

17%)[14]和苹果(Malus pumila, 21%)[18]。李林海等[19]

应用MSAP技术对巴西橡胶树‘热研8-79’的老态和幼态无性系叶片基因组DNA甲基化进行了研究, 认为幼态无性系的甲基化率为33.2%，老态无性系的甲基化率为22.9%，略高于本研究的平均甲基化率。差异产生的原因可能与实验材料及检测方法(如引物数量、引物的差异、银染检测条件等)等相关。

对木本植物发育阶段的DNA 甲基化水平和模式已有研究报道。Fraga等[20]报道成年期木本植物的分生组织的甲基化水平显著高于童期和类童期分生组织；Monteuuis等[21]认为随着树木发育DNA甲基化水平和模式会发生改变。本研究结果表明，巴西橡胶树体细胞胚发生过程中不同组织间的DNA甲基化水平存在一定差异，其中体细胞胚的DNA甲基化水平最低，为21.682%，而花药的DNA甲基化程度最高，为22.724%。在巴西橡胶树体胚发生过程中，每个阶段都存在DNA甲基化和去甲

第5期李辉亮等：巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析533

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